免疫系統是由先天免疫系統和適應性免疫系統組成的保護機體免受外界病原體侵害的系統。硬骨魚類生活在病原菌豐富的水環境中，廣泛接觸多種病原菌，先天免疫系統在硬骨魚類中發揮著更為重要的作用。吞噬作用是先天性免疫應答的重要機制之一，它通過吞噬細胞吸收病原體，降解攝入的病原體，激活免疫應答。這一進展始于模式識別受體（PRRs）對病原體的識別，PRRs包括凝集素、Toll樣受體、NOD樣受體和B類清道夫受體以及其他受體。B類清道夫受體參與了吞噬作用，但對其在硬骨魚類中的作用的認識還很有限。B類清道夫受體包括CD36、SR-B和溶酶體整合膜蛋白2（LIMP-2），LIMP-2在溶酶體和晚內切體的限制膜中的表達，LIMP-2的過度表達導致了早內切體和晚內切體/溶酶體的增大，一些研究已經報道LIMP-2在哺乳動物中的免疫作用，但是LIMP-2在硬骨魚類中的免疫作用還不清楚。

大菱鲆是我國海水養殖為廣泛的魚類之一，常患有鰻弧菌和海豚鏈球菌感染等細菌性疾病。為了制定防治措施，青島農業大學楊寧教授科研團隊對大菱鲆細菌感染過程中的免疫相關基因及其相關活性進行了研究，此外，黏膜免疫反應是宿主防御的第yi道防線，對于生活在病原菌豐富的水生環境中的水生生物更為重要。更好地了解黏膜免疫反應有助于通過浸泡或喂養來制定疾病控制和預防措施。基于以上問題，作者試圖描述大菱鲆的LIMP-2基因結構、不同細菌感染后粘膜組織中LIMP-2的表達情況，以及LIMP-2的微生物配體結合活性和凝集活性，以初步了解其在硬骨魚類中的免疫作用。

基本信息

題目：

Identification and initial functional characterization of lysosomal integral membrane protein type 2 (LIMP-2) in turbot (Scophthalmus maximus L.)

期刊：Developmental & Comparative Immunology

影響因子：3.119

PMID：31176756

作者單位：青島農業大學

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摘要

免疫系統保護生物體免受外來病原體的侵害，這一進展始于模式識別受體（PRRs）對病原體的識別。B類清道夫受體作為PRRs的一種，在吞噬功能中發揮著重要作用。在三種B類清道夫受體中，LIMP-2被報道存在于溶酶體和晚內切體的限制膜中，但是它在硬骨魚種中的免疫作用仍然局限于少數物種。在此，作者對大菱鲆LIMP-2基因進行了研究，分析了LIMP-2基因在不同細菌感染后黏膜屏障中的表達模式以及LIMP-2與不同微生物配體的結合活性和與不同細菌的凝集活性。作者鑒定出一個具有1593 bp開放閱讀框（ORF）的SmLI

MP2基因，多個物種的比較和系統進化樹分析表明，該基因與牙鲆的親緣關系密切，基因組結構和共線性分析顯示了LIMP-2在進化過程中的保守性。在組織分布分析中，SmLIMP-2在所有被檢測的大菱鲆組織中均有表達，其中腦組織表達水平高，肝組織表達水平低。此外，SmLIMP-2在革蘭氏陰性菌鰻弧菌感染后所有粘膜組織（皮膚、鰓和腸）中均顯著上調，在革蘭陽性菌鏈球菌感染后的鰓中上調。后，rSmLIMP-2與所檢測的所有微生物配體均表現出較強的結合能力，并與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌有較強的凝集作用。綜上所述，該研究結果表明SmLIMP-2在魚類對細菌感染的免疫反應中起著重要作用。然而，需進行進一步功能研究，以更好地描述其在硬骨魚類免疫中的詳細作用。

研究內容及結果

1.大菱鲆LIMP2基因的鑒定

分子克隆后，獲得一個具有1593bp開放閱讀框（ORF）的SmLIMP2基因（GenBank登錄號：MH748107）。ORF編碼530個氨基酸殘基，預測分子質量為59.95kDa，理論等電點為6.44。推測得到的SmLIMP2蛋白具有9個蛋白激酶C磷酸化位點、11個酪蛋白激酶II磷酸化位點和10個N-糖基化位點。此外，推測得到的SmLIMP2蛋白有55個帶負電的殘基（Asp+Glu），52個帶正電的殘基（Arg+Lys），不穩定性指數為37.18，脂肪族指數為87.49。與其它物種相比，SmLIMP2基因與褐牙鲆的相似性高，為97.0%，其次是大黃魚94.9%，虹鱒94.5%，而與褐牙鲆的同源性高，為92.5%，其次是大黃魚89.6%，半滑舌鰨94.5%。

Table 2

2.SmLIMP2基因的基因組結構分析

作者利用大菱鲆基因組數據庫研究了SmLIMP2的基因組結構，并與已發表的LIMP2基因對比了外顯子/內含子結構。作者發現有趣的是，在人、鼠和雞中的LIMP2有12個外顯子，而硬骨魚類有13個外顯子。而且，人和小鼠的12個外顯子*相同，而雞中只有兩個外顯子是與人和鼠是不同的。此外，在硬骨魚類含有的13個外顯子中，大菱鲆和斑馬魚只有1個外顯子不同，大菱鲆和鯰魚只有2個外顯子不同，斑馬魚和鯰魚只有1個外顯子不同。

Figure 1

3.系統進化樹分析

作者利用MEGA 6對不同物種LIMP2的氨基酸序列進行了系統進化樹分析。結果顯示，SmLIMP2先與褐牙鲆聚集，然后依次與大黃魚、半滑舌鰨、虹鱒聚集。另一個進化枝由鯉魚（C. carpio）、斑馬魚（D. rerio）和斑點叉尾鮰（I. punctatus）組成。其他較高等的脊椎動物形成了單個進化分支，包括人（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）、雞（G.gallus）和熱帶爪蟾（X. tropicalis）。

Figure 2

4.SmLIMP2基因的共線性分析

 通過共線性分析進一步驗證了SmLIMP2的鑒定。結果顯示，從哺乳動物到脊椎動物的物種中都觀察到了LIMP2的相同相鄰基因。其中在大菱鲆、鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到SmLIMP2的鄰近基因都包含158個螺旋結構域（CCDC158）、序列相似家族47成員E（FAM47E）和具有EF-hand結構域2的蛋白磷酸酶（PPEF2）。然而，N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（NAAA）只在鯰魚、雞、小鼠和人中觀察到。

Figure 3

5.SmLIMP2的組織分布

作者采用Real-time PCR的方法，研究了SmLIMP2在大菱鲆皮膚、鰓、腸、血、肝、脾、頭腎、腦等8種健康組織中的組織分布規律。結果顯示，SmLIMP2在所有被檢測的組織中廣泛表達，其中，在腦中表達水平高（26.44倍），其次是腸（9.93倍）和皮膚（6.03倍），而在肝臟中表達水平低（對照）。

Figure 4

6.細菌攻擊后SmLIMP2的表達譜

為了研究SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織中的免疫作用，作者用革蘭氏陽性菌S.iniae和革蘭氏陰性菌V.anguillarum浸泡攻擊大菱鲆后，檢測了SmLIMP2在大菱鲆粘膜組織（鰓、皮膚和腸）中的表達譜。

在感染S.iniae后，SmLIMP2只在鰓中上調，在皮膚和腸中下調，具體表現為：在腮中，4h快速上升6.97倍，8h快速上升4.06倍，12h迅速恢復到基礎水平；在腸中，2h下降幅度大，達0.17倍，其余時間點迅速恢復到基礎水平。在皮膚中，SmLIMP2在2小時下調0.37倍，8小時下調0.68倍。

在V.anguillarum感染后，三種組織中SmLIMP2的表達情況均上調。具體表現為：在腮中，在2小時時檢測到高的上調，上調幅度為7.52倍。在皮膚中，在2小時時上調4.68倍，在12h時上調4.34倍。

Figure 5

Figure 6

7.微生物配體的體外結合

在表達譜分析之后，作者又研究了SmLIMP2與微生物配體的結合能力。rSmLIMP2是從大腸桿菌中純化出來的一種天然His標記蛋白，并且只有SmLIMP2的胞外區被誘導，在western blot分析中，只觀察到一條分子量為50kDa的帶。后，研究了SmLIMP2與微生物配體和虹彩病毒（iridovirus）的結合能力，具體表現為：對照蛋白與被測配體沒有任何結合能力，而rSmLIMP2對LPS的結合能力強，其次是iridovirus、PGN和LT。PGN和LTA均在4μg/ml時達到峰值，而LPS和iridovirus均在8μg/ml時達到峰值。

Figure 7

Figure 8

8.凝集試驗

作者用凝集試驗進一步鑒定LIMP2的免疫功能。在含鈣的TBS緩沖液中的凝集試驗表明，rSmLIMP2能夠引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌強烈的凝集，其中，大腸桿菌和鰻弧菌的凝集作用更強。

研究結論

綜上所述綜合基因組結構、系統進化樹和共線性分析，作者驗證了SmLIMP-2的鑒定，并表明其與相應的脊椎動物物種顯示出很強的同源性。LIMP-2在大菱鲆腸道和皮膚中的大量表達可能提示LIMP-2在大菱鲆黏膜免疫中的重要作用，但是由于LIMP-2在硬骨魚類中的信息有限，需要進一步研究LIMP-2在不同組織和不同類型細胞中的表達水平。鰻弧菌感染后大菱鲆三種粘膜組織SmLIMP-2的表達均上調，作為模式識別受體（PRRs）的一員，黏膜組織中SmLIMP-2的快速上調提示了大菱鲆對細菌感染的病原體識別和宿主免疫激活。rSmLIMP2與LPS、PGN和LTA等微生物配體呈劑量依賴性結合，與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鰻弧菌有較強的凝集作用，根據之前的研究，這一結果暗示著LIMP-2可能參與病原體識別、抗原提呈、巨噬細胞活化和炎癥過程。然而，LIMP-2在硬骨魚類中的應用還很有限，需要進一步研究以更好地描述其在硬骨魚類免疫中的具體作用。

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