（胺鹽） 三鹽酸精脒

（胺鹽） 三鹽酸精脒相關實驗：

一氧化氮(nitricoxide，NO)是生物體內發揮重要生理功能的氣體小分子。

1998年， 美國藥理學家RobertF.Furchgott、LouisJ.Ignarro及FeridMurad因揭示了NO在心血管系統中的信號分子作用而獲得諾貝爾生理學和醫學獎[1]，這將人們對NO的相關研究推向了新的高潮。在生物體內，NO通過一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)利用L-精氨酸(L-Arg)和分子氧作為底物，在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷(nicotinamideadeninedinucleotide2'-phosphate，NADPH)輔酶作為輔助因子提供電子的條件下，由黃素腺嘌呤二核(flavinadeninedinucleotide，FAD)、黃素單核苷酸(flavinmononucleotide，FMN)、四氫葉酸(tetrahydrofolate,THF)傳遞電子，催化L-Arg的兩個等價胍基氮之一經氧化反應生成NO和L-瓜氨酸(L-citrullin)[2](圖1)。

NOS有三種同工酶，包括：主要存在于神經系統中的神經型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS，是先被發現的NOS，故又稱NOS-Ⅰ)，存在于巨噬細胞、肝細胞、神經膠質細胞中的可誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS，又稱NOS-Ⅱ)，以及主要存在于血管內皮細胞中的內皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS，又稱NOS-Ⅲ)[3,4]。其中，nNOS和eNOS均為構成型酶，統稱為構成型一氧化氮合酶(constitutivenitricoxidesynthase，cNOS)在神經系統中，NO作為一種重要的信使分子，參與了學習與記憶等重要的神經生理活動，同時對腦部血流具有調節作用，并參與神經系統的免疫防御[5～8]。

而另一方面，過量的NO又與腦缺血損傷、早老性癡呆及帕金森氏癥等神經系統疾病的發生、發展有著密切的關系[9,10]。因此，在正常生理條件下，神經系統中存在著從時間和空間上調控NO產生、釋放、擴散與滅活的機制，而這主要是通過調控nNOS的活化與去活化實現的。nNOS除了在神經系統中具有重要功能外，在骨骼肌、心肌和平滑肌當中也有表達分布，在這些組織中，NO對血流調節和肌肉收縮都具有重要的調控作用[11～13]。 作為一種構成型一氧化氮合酶，nNOS的活性主要依賴于翻譯后水平上鈣離子(Ca2+)/鈣調蛋白(calmodulin，CaM)的調控。隨著研究的深入，越來越多的證據表明，生物體內的nNOS調控有著復雜的機制，其酶活性在多個水平上受到調節，包括二聚化、多位點的磷酸化與去磷酸化，以及蛋白質與蛋白質的相互作用等。本文將著重對nNOS活性的調控機制進行綜述。 nNOS的二聚化 NOS的活性受到酶構型的影響，二聚化對于NOS三種同工酶的活性都是*的。每一種NOS同工酶都具有相同的催化中心結構：羧基端為還原酶區(reductasedomain，NOSred)，該區域與NADPH結合，還包含FAD和FMN的結合位點；氨基端為氧化酶區(oxygenasedomain，NOSox)，此區域與底物L-Arg結合，還包含一個四氫生物蝶呤(BH4)結合位點和一個細胞色素P-450樣亞鐵血紅素輔基的活性位點。NADPH提供的電子通過FAD和FMN，由還原酶區向氧化酶區傳遞[14]。活化的nNOS為二聚體形式，兩個單體的氧化酶區之間形成的擴大界面為BH4和L-Arg創造了高親和力的結合位點[15,16]，從而促進電子的傳遞。一些nNOS的抑制劑，如7-硝基吲唑(7-NI)，可以降低BH4和L-Arg與nNOS的親和力，從而抑制nNOS的活性[17]。對iNOS的研究發現，電子是由一個單體的還原酶區向另一個單體的氧化酶區傳遞的，這也可能是NOS在單體形式下不表現活性的原因[18]。

此外，穩定的二聚體形式的nNOS更不易被水解，一些nNOS的底物類似物，如N(G)-硝基-L-精氨酸，可以穩定nNOS的二聚化形式，使其不發生泛素化，同樣，BH4和亞鐵血紅素的結合也會促使nNOS形成穩定的二聚體[19]。 nNOS的磷酸化調控 nNOS的活性受到多種激酶和磷脂酶的調控。蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、鈣調蛋白依賴激酶(CaMkinases，CaMk)Ⅰ和Ⅱ，以及蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA)，均可通過磷酸化修飾nNOS而調控其活性。nNOS有多個可發生磷酸化的位點，不同位點發生的磷酸化和去磷酸化，對nNOS的酶活性有不同的影響。CaMKⅠ磷酸化nNOS的Ser741殘基，CaMKⅡ磷酸化Ser847殘基，通過抑制與Ca2+/CaM的結合而降低nNOS的活性[20,21]。相反，蛋白磷酸酶1可以通過降低Ser847位的磷酸化水平使nNOS的活性升高[22]。發生在Ser1412殘基的磷酸化可增加nNOS的活性，而該位點的去磷酸化則使nNOS的活性降低[23]。 蛋白質-蛋白質相互作用對nNOS活性的調控 近年來的研究發現，nNOS可以與多種蛋白發生相互作用，這些相互作用的發生可以影響nNOS在細胞中的定位或直接影響nNOS的活性。

nNOS基因的外顯子2編碼了一段特殊肽段—— —PDZ結構域(PSD-95/Dlg/ZO-1homologydomain)，該結構域不但參與nNOS的二聚化(活化)，由該結構域介導的蛋白質-蛋白質相互作用也是nNOS與其它蛋白互作的重要方式之一，與nNOS的空間定位及功能有著密切的關系。鈣調蛋白 NOS的還原酶區和氧化酶區由CaM結合區連接起來，只有與CaM結合之后，NOS才具有催化活性。CaM作為分子開關，能夠促進電子從NADPH轉移到亞鐵血紅素活性中心的效率[24]。Ca2+/CaM不存在的條件下，電子由FAD向FMN傳遞的速度會降低[25]。iNOS的活性調控主要發生在基因轉錄水平上，即使在低Ca2+濃度的條件下，CaM與iNOS的結合也十分緊密，因此，iNOS的活性基本不受Ca2+濃度的影響。cNOS則不同，在靜息態下，cNOS保持低活性，隨著胞內Ca2+濃度的升高，CaM與cNOS結合而導致酶活性上升，而胞內Ca2+濃度降低時，CaM會從cNOS上脫離，使酶活性下調。可見，cNOS的活性受到胞內Ca2+濃度的調控[26,27]。研究表明，熱休克蛋白90能夠促進CaM與nNOS的結合，激活nNOS，進而上調NO的產生[28,29]。N-甲基-D-天冬氨酸受體 膜蛋白N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDA-R)在nNOS的活性調控中起著重要作用。神經元中，nNOS的活化依賴于興奮性氨基酸信號偶聯的Ca2+內流信號。在突觸后神經元中，谷氨酸等興奮性氨基酸通過NMDA-R引發Ca2+內流，導致細胞內Ca2+濃度升高，Ca2+結合CaM后激活nNOS產生NO，因此，NMDA-R是神經系統中重要的nNOS活化因素之一[30]。此外，NMDA-R還可以通過其它方式調控nNOS的活性。一方面，NMDA-R可以通過CaMKⅡ和鈣調神經磷酸酶(calcineurin)調節nNOS的磷

亞精胺對誘導ＤＮＡ凝聚行為的影響研究

利用原子顯微鏡技術（AFM）研究了亞精胺加入次數及不同培養培養時間對DNA凝聚行為的影響，研究表明，DNA的凝聚次數由亞精胺的加入次數跟時間決定，隨著加入次數的增加，DNA凝聚減慢，凝聚體尺寸變大，隨著培養時間的增加，DNA凝聚體減慢，凝聚體尺寸變大，隨著時間的增加，DNA凝聚體變得越來越緊湊。

有哪些潛在原因可導致用T4 DNA連接酶連接后轉化失敗?

反應體系內無ATP或Mg2+可導致連接失敗：使用隨酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加ATP。含ATP的Buffer保存超過1年，其內ATP可能會降解，導致連接失敗。當補加ATP時，確定補加的是核糖核酸ATP，而不是脫氧核糖核酸ATP，因為后者不起作用。

反應體系中鹽濃度過高或EDTA含量高都可導致連接失敗：純化DNA。 去磷酸化步驟完成后，CIP、BAP或SAP失活不*：根據廠家推薦的方法去除去磷酸化酶DNA濃度過高導致連接后產生的均是線性DNA：保持總DNA濃度在1-10μg/ml之間。連接末端為單堿基突出末端：使用高5μl高濃度連接酶16°C連接。插入片段和質粒沒有磷酸化。注意：如果載體已經去磷酸化了，而引物又沒有磷酸化會導致連接失敗，訂購磷酸化的引物或對引物進行磷酸化。

加入過多的連接混合物感受態細胞：50μl感受態細胞應加入1-5μl連接混合物。

插入片段太大，不能進行環化：降低插入片段的濃度，并使用高濃度連接酶16°C連接。

連接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物進行檢測。

連接混合物含有PEG且連接反應：長時間地在含有PEG的條件下連接可導致轉化效率降低，這可能是由于逐漸產生的大片段線性DNA抑制了轉化效率。快速連接試劑盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。

電轉化前沒有提純連接混合物：電轉化必須去除buffer，否則鹽會導致瞬間放電，擊穿細胞。可用透析或柱純化的方法純化連接混合物。雖然快速連接試劑盒（NEB# M2200）buffer
中含有的PEG不會導致擊穿細胞，但是會抑制電轉化，所以必須去除，可用柱純化方法去除PEG。   Q2：解決轉化問題時，還有什么因素需要考慮？

感受態細胞出了問題：設置下面列出的實驗對照，必要時更換新鮮感受態細胞。

細胞不是感受態：設置下面列出的實驗對照，必要時更換新鮮感受態細胞。

大腸桿菌不能很好的接受重組蛋白：試用pMAL系統（NEB＃E8000S）表達MBP(麥芽糖結合蛋白)
融合蛋白，或者試用其它不需要大腸桿菌的表達系統。  

連接的DNA片段含有反向重復的序列，不能用大腸桿菌篩選：如果可能去除重復序列，或試用其它不需要大腸桿菌的表達系統。

插入序列來自哺乳動物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，會被很多大腸桿菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。

重組子太大（>10,000 bp）不能進行化學轉化：用電轉化。  

Q3：內切酶酶切反應后，有什么因素可以導致T4 DNA連接酶連接和后續的轉化失敗？

內切酶酶切不充分：如果酶切位點位于PCR產物的末端，識別位點末端側需要加少6個保護堿基。用對照底物檢測內切酶的活性。

內切酶沒有*失活：如果內切酶不能熱失活，用酚/氯仿抽提純化DNA。

內切酶的星號活性消化了載體或插入片段：跑膠檢測DNA，如果存在多余的條帶，減少內切酶使用量或減短反應時間。

DNA或內切酶有外切酶或磷酸酶的污染，
破壞了DNA末端：酚/氯仿抽提純化DNA。檢查內切酶的質量檢測資料和注意事項，如果連接QC不佳或外切酶活性高，減少內切酶量或縮短反應時間。

使用T4 DNA連接酶，需要設置什么對照來檢測細胞和DNA。
注意：每個對照組都使用相同濃度的DNA，一般為0.1-1.0ng/轉化。 

轉化空載體（未切割的）感受態細胞，目的：檢測感受態細胞的質量以及質粒的抗性。分別涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。

轉化線性化后的載體，目的：檢測未切開質粒的量，克隆數應該小于步驟1的1％。

酶切再連接質粒，目的：檢測連接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆數應該與步驟1相近。

酶切后去磷酸化再連接質粒，目的：檢測未*去磷酸化的背景。克隆數應該小于步驟1
的1％。  

Q5：什么情況下選用T4 DNA連接酶？

T4 DNA連接酶應該被用來連接粘性末端（室溫10分鐘）或平末端（室溫2小時），或者連接反應需要。如果需要熱失活連接酶，選用用T4 DNA連接酶。高濃度T4 DNA連接酶被用來連接單堿基突出末端，或連接需要長時間孵育來環化的大片段，比如BAC（細菌人造染色體）結構。  

T4 DNA連接酶能與快速連接buffer兼用嗎？

可以，高濃度T4 DNA連接酶可以直接取代，如果是普通濃度的T4 DNA連接酶，將孵育時間從5分鐘延長到15分鐘。不要進行熱失活，因為加熱會讓buffer內的PEG抑制轉化。反應時間延長也會降低轉化效率。  

T4 DNA連接酶連接應該加多少DNA？

單位定義用的是0.12 μM (300 μg/ml) lambda HindIII。高濃度的DNA用于linker的連接。為了促進環化（有利于轉化），應該控制總DNA濃度于較低水平。載體＋片段總濃度應為：1-10 μg/ml。插入片段和載體的摩爾濃度比介于2-6之間，比例低于2:1會降低連接效率，高于6:1會促進形成多個插入。如果對DNA的濃度不確定，可以做不同比例的多個連接反應。 

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