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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC5410-50T/48S
更新時間：2024-04-19
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：2061
010-50973130
產品分類
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亞鐵離子含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC5410
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體80mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 標準品：10mg FeSO4·7H2O，臨用前加入900μL蒸餾水和20μL濃硫酸，充分混勻，配制成40 mmol/L標準液，2-8℃可保存2周。
產品說明：
鐵是人體必需的微量元素之一，對于維持機體正常生理功能具有重要作用。亞鐵離子是血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素及其他酶系統的重要組成成分，幫助氧的運輸，促進脂肪氧化。缺乏鐵元素容易造成貧血、代謝紊亂，并影響機體的免疫功能。鐵過量是引發或加劇多種慢性病（如糖尿病、心腦血管疾病、神經退化性疾病等）的危險因素。
樣本中的Fe2+在酸性條件下與三吡啶基三嗪形成藍色配合物，在593nm處有吸收峰，通過測定該波長吸光度即可計算Fe2+的含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、可調式移液槍、渦旋震蕩儀、冰、蒸餾水、濃硫酸和氯仿。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
2. 細菌/細胞：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時間5min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若有渾濁請離心后取上清待測。
二、測定步驟
1. 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至593nm，蒸餾水調零。
2. 標準溶液的稀釋：取10μL 40 mmol/L標準液，加入990μL蒸餾水，混勻得到400 μmol/L標準液，將400 μmol/L標準液用試劑一進行稀釋得到100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μmol/L的標準液備用，注意標準溶液需要現用現配。
3. 標準溶液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（μmol/L） | 標準液體積（µL） | 試劑一體積（µL） | 稀釋后濃度（μmol/L） |
1 | 400 | 500 | 1500 | 100 |
2 | 100 | 1000 | 1000 | 50 |
3 | 50 | 1000 | 1000 | 25 |
4 | 25 | 1000 | 1000 | 12.5 |
5 | 12.5 | 1000 | 1000 | 6.25 |
6 | 6.25 | 1000 | 1000 | 3.125 |
7 | 3.125 | 1000 | 1000 | 1.5625 |
備注：實驗中每個標準管需800µL標準液。
4. 在1.5mL離心管中按下表步驟加樣：
試劑名稱（µL） | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 800 | - | - |
標準液 | - | 800 | - |
試劑一 | - | - | 800 |
試劑二 | 400 | 400 | 400 |
充分混勻，37℃靜置10min | |||
氯仿 | 200 | - | - |
充分渦旋震蕩5min，之后12000g常溫離心10min，小心吸取上層無機相800μL于1mL玻璃比色皿，測定593nm處吸光值，記為A測定，計算ΔA測定=A測定-A空白。 | 于593nm處吸光值，記為A標準、A空白，計算ΔA標準= A標準-A空白。空白管和標準曲線只需測1-2次。 | ||
三、亞鐵離子含量計算
1. 標準曲線的繪制：
根據標準管的濃度（x，μmol/L）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，μmol/L）。
2. 亞鐵離子含量的計算：
（1）按血清（漿）等液體體積計算：亞鐵離子含量（μmol/L）=x
（2）按樣本蛋白濃度計算：亞鐵離子含量（μmol/mg prot）=x×10-3×V提取÷（Cpr×V提取）=0.001x÷Cpr
（3）按樣本質量計算：亞鐵離子含量（μmol/g 質量）=x×10-3×V提取÷W=0.001x÷W
（4）按細胞/細菌數量計算：亞鐵離子含量(μmol/106 cell)=x×10-3×V提取÷N= 0.001x÷N
V提取：加入試劑一的體積，1mL；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細菌或細胞總數，以106計；103：單位換算系數，1μmol/L=10-3μmol/mL。
注意事項：
1. 用試劑一稀釋得到的標準液容易失效，建議現用現配。
2. 如果?A測定過低或測定管吸光值接近空白管，可以增加樣本量后再進行測定；如果?A測定大于1，建議將樣本用試劑一適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1、 取0.1026g小鼠肝臟樣本，加入1mL試劑一，冰浴勻漿，離心后取上清按照測定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.315-0.01=0.305，根據標準曲線y=0.0104x-0.008，R2=0.9948，計算x=30.096，按樣本質量計算：
亞鐵離子含量（μmol/g 質量）=0.001x÷W =0.293 μmol/g 質量。
2、 取800μL牛血清，按照測定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定=A測定-A空白=0.400-0.01= 0.390，根據標準曲線y=0.0104x-0.008，R2=0.9948，計算x=38.269，按液體體積計算：
亞鐵離子含量（μmol/L）=x=38.269 μmol/L。
參考文獻：
[1] Dong C, Yang M, Wang W. Study on spectrophotometric determination of Fe(Ⅱ) and Fe(Ⅲ) with 2, 4, 6- tri(2′-pyridyl)-1, 3, 5-triazine. [J]. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2004, (01):76-78.
[2] Huang Y, Ma H, Xu J, et al. Development and Validation of Reference Methods for Determination of Serum iron. [J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2011, 15(03):453-457.
[3] Wang H, Liu B, Ding Z, et al. Ferene method flow injection analysis as optimized in situ analysis of dissolved iron in marine waters. [J]. Marine Sciences, 2016, 40(05):82-87.
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