輔酶Ⅰ NAD(H)含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC0315
規格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
1、試劑三：需要嚴格避光；
2、試劑六：19.2 mL乙醇和0.8 mL蒸餾水混合，備用；
3、NAD標準品：臨用前加入1.5 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NAD標準溶液備
用；
4、NADH標準品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即2 µmol/mL，將其稀釋為1.25 nmol/mL的NADH標準溶液備用。
產品說明：
輔酶I包括還原型和氧化型兩種形式，在生物氧化中起傳遞氫的作用。氧化型輔酶I又稱煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脫氫酶的輔酶，它在糖酵解、糖異生、三羧酸循環和呼吸鏈中發揮著不可替代的作用。中間產物會將脫下的氫遞給NAD，使之成為NADH（還原型輔酶I）。而NADH則會作為氫的載體，在呼吸鏈中通過化學滲透偶聯的方式，合成ATP。NAD(H)在機體內有重要的生理意義，與物質代謝、能量代謝、抗細胞衰老、抗氧化以及一些疾病的發生密切相關。體內輔酶I含量降低會導致細胞損傷或衰亡。
分別用酸性和堿性提取液提取樣本中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值，而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟： 具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：
1、操作過程應避光。不可將試劑一、二、三混合后再加，必須分開加。
2、反應過程要注意避光。
3、當吸光值大于1時，建議稀釋后測量。
實驗實例：
 

1. NAD⁺的提取：稱取約0.1g肌肉按照提取和測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.507-0.2=0.307，ΔA標準1=A標準1-A空白=0.612-0.144=0.468，按樣本質量計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 質量。

NADH的提取：稱取約0.1g肌肉按照提取和測定步驟操作，用96孔板測測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.183-0.077=0.106，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.399-0.143=0.256，按樣本質量計算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 質量。

1. NAD⁺的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測定步驟操作，用96孔板測測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.171-0.101=0.07，ΔA標準1=A標準1-A空白=0.612-0.144=0.468，按樣本質量計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺ (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 質量。

NADH的提取：稱取約0.1g柳樹葉，按照提取和測定步驟操作，用96孔板測測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.152-0.099=0.053，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.399-0.143=0.256，按樣本質量計算NADH 含量得：NADH  (nmol/g 質量）=1.25×ΔA測定÷ΔA標準2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 質量。

1. NAD⁺的提取：取0.1mL火雞血清，按照提取和測定步驟操作，用96孔板測測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.120-0.071=0.049，ΔA標準1=A標準1-A空白=0.612-0.144=0.468，按液體體積計算NAD⁺ 含量得：NAD⁺含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測定÷ΔA標準1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。

NADH的提取：取0.1mL馬火雞血清，按照提取和測定步驟操作，用96孔板測測得計算ΔA測定管= A測定-A對照=0.089-0.065=0.024，ΔA標準2=A標準2-A空白=0.399-0.143=0.256，按液體體積計算NADH 含量得：NADH含量(nmol/mL）=12.5×ΔA測定÷ΔA標準2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。
相關發表文獻：

1. Xiaofen Fu,Pengsong Li,Lei Zhang,et al. Understanding the stress responses of Kluyveromyces marxianus after an arrest during high-temperature ethanol fermentation based on integration of RNA-Seq and metabolite data. Applied Microbiology and Biotechnology. March 2019;103(6) :2715–2729.(IF3.67)

2. Mengqing Tao,Jia Jiang,Lin Wang,et al. α-Mangostin Alleviated Lipopolysaccharide Induced Acute Lung Injury in Rats by Suppressing NAMPT/NAD Controlled Inflammatory Reactions. Evidence-Based Complementary and

Alternative Medicine. 2018;(IF1.984)

1. Bin Zhang,Dongmei Shi, Xiangyu Zhang,et al. FK866 inhibits the epithelial-mesenchymal transition of hepatocarcinoma MHCC97-H cells. Oncology Letters. October 2018;(IF1.871)

2. Yang K, Yin Q, Mao Q, et l. Metabolomics analysis reveals therapeutic effects of α-mangostin on collagen-induced arthritis in rats by down-regulating nicotinamide phosphoribosyltransferase[J]. Inflammation, 2019, 42(2): 741-753.

參考文獻：

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2. Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinucleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the reduced tetrazolium[J]. Analytical biochemistry, 1997, 251(2): 153-157.

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